Aqui nós descrevemos uma técnica de custo-benefício para a cultura de retina organotípicas suína adulto por sete dias. Resumidamente, um papel estéril filtro foi utilizado para levantar a retina neural fora do RPE e do lado coloque fotorreceptoras em cima uma inser??o levantadas por um carrinho feito por encomenda.

Neste vídeo, descrevemos um protocolo para cultura organotípica de ci adulto de espessura total e retina. Este desenho mostra o procedimento geral. Primeiro, remova o segmento anterior do olho de porco adulto.

Use uma árvore de seis milímetros, encontre a l?mina para fazer uma explica??o de espessura total do pólo posterior. Prenda suavemente um peda?o de papel estéril no lado das células ganglionares da retina. Descasque cuidadosamente a retina do epitélio pigmentar da retina.

Coloque o papel de filtro com o lado do fotorreceptor complexo de retina para cima em uma inser??o de placa de cultura de células, que está apoiada em um suporte feito sob medida dentro de uma placa de cultura. Bem, o suporte melhora o suprimento de oxigênio e nutrientes para a retina, permitindo mais espa?o para o meio abaixo da amostra Para fazer um suporte, uma ponta de pipeta de cinco milímetros foi cortada perto da base para produzir um cilindro oco de seis milímetros de comprimento e, em seguida, peda?os foram removidos da lateral do cilindro para criar as três pernas. A inser??o é ent?o colocada dentro do suporte para criar um complexo estável.

O inserto de cultura e o complexo de base s?o montados, colocados dentro de uma placa de cultura e preenchidos com meio para cobrir o filtro da cultura de células. Inserir. Os filtros de cultura estéreis s?o preparados por autoclave de papel de filtro Watman. Os olhos suínos s?o obtidos em um matadouro local dentro de três horas após o sacrifício do animal.

Estas s?o as ferramentas necessárias para a disseca??o. Um microscópio de disseca??o é usado para visualizar melhor a retina. O tecido estranho é aparado do globo ocular.

O olho é mergulhado em Betadine e lavado com solu??o de irriga??o estéril. A gaze BSSA dois a dois é umedecida. O nervo óptico óptico é cuidadosamente cortado.

Uma incis?o de quatro a cinco milímetros é feita com uma l?mina. Tesouras curvas s?o usadas para fazer um corte circunferencial perto da jun??o entre o corpo ciliar e a retina neural. O segmento anterior junto com o vítreo s?o removidos, deixando a retina neural no pólo posterior.

Uma multa de árvore de seis milímetros é usada para fazer uma explica??o de espessura total através do pólo posterior. Um papel de filtro estéril é cuidadosamente aplicado no lado das células ganglionares da retina. Uma vez que o papel de filtro está totalmente umedecido, a retina se separa da camada RP subjacente descascando o papel de filtro, os complexos de retina do papel de filtro e colocado logo abaixo do nível do meio de cultura na inser??o da placa de cultura preparada.

Aqui está a configura??o da cultura. Aqui est?o as condi??es da cultura. Após quatro dias de cultura, a explica??o da retina suína permanece plana no papel de filtro.

Aqui está uma explica??o de retina de quatro dias sem papel de filtro po hand retinal foi fixada e seccionada por um criostato ou um viome. Após a fixa??o, a retina se separa do papel de filtro por meio de uma espátula, o excesso de líquido é removido para as se??es congeladas. Fa?a uma moldura de bloco quadrado usando cera dental.

Coloque-o ao redor da explica??o retiniana de seis milímetros e mergulhe tudo no composto OCT de tecnologia de tecidos. Depois que o bloco de amostra é completamente congelado, ele é colocado em uma plataforma de amostra de criostato. Verticalmente, minha própria plataforma de amostra para garantir que o bloco esteja na vertical em rela??o à l?mina.

Retire a cera dentária e comece a fazer o corte na espessura desejada, coloque os cortes em l?minas tratadas com gelatina para cortar a retina com o micrótomo vibratório. O explante é embebido em ágar 4%. O ágar 4% é derretido em banho-maria fervente e despejado em um pequeno recipiente de plástico.

Quando resfriada a cerca de 50 graus Celsius, a amostra de retina é ent?o mergulhada no ágar derretido usando uma espátula. O bloco de ágar é solidificado a quatro graus Celsius e cortado em um pequeno cubo. Com a retina no meio, o bloco é colado ao estágio de um vibram.

Usando cola maluca, a retina é montada de forma que tenha um ?ngulo de 90 graus em rela??o à l?mina Vibram. As se??es de 50 mícrons de espessura foram transferidas debaixo d'água para uma l?mina de vidro usando uma imuno-histoquímica com escova macia. Para a proteína da vesícula sináptica, duas proteínas ácidas fibrilares gliais s?o realizadas usando qualquer protocolo padr?o.

Os cortes também foram corados com iodeto de propídio. Para visualiza??o nuclear, as se??es imunomarcadas s?o visualizadas com um microscópio confocal. Aqui est?o as se??es mortas crassas imunomarcadas.

?s vezes zero, aos quatro dias, aos sete dias, a estrutura da se??o da retina ainda permanece intacta. A retina de porco cultivada tem potencial para muitos tipos diferentes de estudos. Existem muitas semelhan?as entre a retina de porco e humana.

Portanto, quando a retina humana de alta qualidade se torna prontamente disponível, presumivelmente técnicas semelhantes podem ser aplicadas ao estudo de sua morfologia e funcionalidade. Para mais detalhes, consulte o manuscrito.