Este estudo tem como objetivo desenvolver um novo modelo de cultura de retina organotípica humana (HORC) que previne comprometer a integridade da retina durante o manuseio da explant. Isso é conseguido através da cultura da retina com o vítreo sobrelada e o pigmento de retina subjacente epitélio-coroide (RPE-choroid) e esclera.

Esta técnica preserva todas as camadas de retina e tipos de células in situ, tornando-a mais clinicamente relevante em compara??o com modelos animais e in vitro. A principal vantagem deste protocolo é que ele minimiza a interrup??o da integridade da retina durante o manuseio do tecido, o que é essencial na compara??o da retina saudável e doente. Doen?as da retina podem ser imitadas por cultura do tecido em condi??es específicas.

Isso permite testar novas terapias medicamentosas. Os procedimentos de dissec??o e coleta de amostras s?o complexos. Portanto, a demonstra??o visual é fundamental para ajudar os leitores a entender o protocolo escrito e conduzir o procedimento com sucesso.

Demonstrando o procedimento estará Charisse Kuo, aluna do segundo ano de doutorado do meu laboratório. Prepare o meio de cultura contendo a mistura de médio/nutriente modificado da ?guia Modificada de Dulbecco F-12 e uma mistura de antibióticos e antimícticos uma vez. Primeiro, coloque 500 microliters de médio em uma placa de 24 po?os e equilibre-o em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Ter a mídia pronta antes da extra??o de explant evita o desalojar da retina após a adi??o subsequente. Para extrair explana??es de retina, comece colocando a xícara ocular em uma placa de Petri com a íris e a lente voltadas para cima e o ONH entrando em contato com a placa de Petri. Segure a xícara ocular firme no limbus usando fórceps e desprende a íris e a lente fazendo pequenos cortes circunferencialmente ao longo da borda externa do limbus.

Remova a íris e a lente cuidadosamente, certificando-se de evitar perturbar a retina. Identifique o ONH usando uma fonte de luz branca brilhante e inciso nos quatro quadrantes em dire??o ao ONH girando a placa de Petri para facilitar o manuseio. Espalhe e achate a opaia cuidadosamente.

Aplique as fórceps na esclera em vez da retina para evitar interromper a integridade da retina. Remova a placa que contém a mídia preparada da incubadora. Coloque uma trefina cirúrgica na retina em uma regi?o sem dobras de retina e pressione fortemente para penetrar a esclera, o que deve gerar um som de rachaduras à medida que você rompe a placa de Petri.

Gire a trefina para garantir que a esclera tenha sido penetrada totalmente de tal forma que a explanta da retina esteja agora separada do resto da amostra. Aplique as fórceps na esclera e transfira a explanta de retina sanduíche para o meio de cultura. Cultura o sanduíche coletado explanta retina a 37 graus Celsius por até 72 horas em uma incubadora umidificada de 5% de dióxido de carbono.

A hematoxilina e a colora??o de eosina mostraram que as explana??es de retina do sanduíche preservavam a integridade e uma estrutura lamellae distinta do GCL ao ONL com núcleos compactos nas camadas nucleares internas e externas. A integridade da retina interrompida foi encontrada nas bordas da mesma amostra onde a retina se desprendeu do coroide e esclera rpe subjacente mostrando redu??o da espessura da retina e perda de núcleos no INL e ONL. Nenhum núcleo celular tunel positivo, que marca a apoptose celular, foram encontrados em explana??es de retina cultivadas em condi??es basais, demonstrando vitalidade celular sustentada mesmo após 72 horas.

A rotulagem GFAP foi restrita à GCL e ao IPL sem fibrose gliana, um sinal de patologia que seria identificada como express?o estendida de GFAP no ONL. Vimentina foi altamente expressa da camada de células g?nglios para a camada nuclear externa, mostrando a integridade celular de Mueller preservada como visto em tecidos normais da retina. O ensaio magnético luminex mostrou que os níveis IL-18, VEGF, IL-6 e IL-8 aumentaram significativamente acima da linha de base nas culturas de explante de retina sanduíche em alta glicose e citocinas pró-inflamatórias após 24 horas.

Após 72 horas, os níveis IL-18 e VEGF permaneceram significativamente aumentados, mas nenhuma diferen?a significativa foi encontrada nos níveis IL-6 e IL-8. Ao realizar este procedimento, deixe o suficiente de vítreo residual suficiente, que pesará a retina para baixo para que n?o se desprende do RP choroide e flutue na mídia cultural. A retina cultivada pode ser ainda caracterizada usando imunestoquímica e histologia, enquanto as citocinas inflamatórias liberadas no meio cultivado podem ser medidas usando um ensaio magnético Luminex.

Este modelo é mais clinicamente traduzível em compara??o com modelos animais e in vitro, o que torna mais adequado para testar a eficácia de novos fármacos terapêuticos para doen?as da retina.