Это исследование направлено на разработку новой модели органотипической культуры сетчатки человека (HORC), которая предотвращает компрометацию целостности сетчатки во время эксплантации. Это достигается путем культивирования сетчатки с шелужащимся стекловидным и нижележащим пигментом сетчатки эпителием-сосудистой оболочкой (RPE-сосудистой оболочкой) и склерами.

Этот метод сохраняет все слои сетчатки и типы клеток in situ, что делает его более клинически значимым по сравнению с моделями животных и in vitro. Основным преимуществом этого протокола является то, что он сводит к минимуму нарушение целостности сетчатки во время обработки тканей, что важно при сравнении здоровой и больной сетчатки. Заболевания сетчатки могут быть имитироваться путем культивирования ткани в определенных условиях.

Это позволяет тестировать новые лекарственные препараты. Процедуры вскрытия и отбора образцов являются сложными. Поэтому визуальная демонстрация имеет решающее значение, чтобы помочь читателям понять письменный протокол и успешно провести процедуру.

Продемонстрировать процедуру будет Чарисс Куо, аспирант второго курса из моей лаборатории. Приготовьте культурную среду, содержащую модифицированную смесь F-12 модифицированной орлиной среды Dulbecco и однократную смесь антибиотиков и антимикотиков. Во-первых, поместите 500 микролитров среды в 24-луночную пластину и уравновешивайте ее в увлажненный инкубатор при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.

Наличие среды готовой к экстракции экспланта позволяет избежать смещения сетчатки при последующем добавлении. Для извлечения эксплантов сетчатки начните с размещения наглазника на чашке Петри с радужной оболочкой и линзой, обращенными вверх, и ONH, контактируя с чашкой Петри. Держите наглазник устойчивым на лимбе с помощью щипцов и отсоединяйте радужную оболочку и хрусталик, делая небольшие надрезы по окружности вдоль внешнего края лимбуса.

Осторожно удалите радужную оболочку и хрусталик, стараясь не беспокоить сетчатку. Определите ONH с помощью яркого источника белого света и наденьте четыре квадранта в сторону ONH, вращая чашку Петри для облегчения управления. Аккуратно разложите и расплющите наглазник.

Нанесите щипцы на склеру вместо сетчатки, чтобы избежать нарушения целостности сетчатки. Выньте из инкубатора пластину, содержащую подготовленную жиму. Поместите хирургический трефин на сетчатку в область без складок сетчатки и сильно надавите, чтобы проникнуть в склеру, которая должна генерировать трескучий звук, когда вы прорываетесь через чашку Петри.

Поверните трефин, чтобы убедиться, что склера была полностью проникла так, что эксплант сетчатки теперь отделен от остальной части образца. Нанесите щипцы на склеру и перенесите эксплант сетчатки сэндвича в культуральную среду. Культивируйте собранный сэндвич ретиналью при 37 градусах Цельсия в течение 72 часов в увлажненный 5% углекислый инкубатор.

Окрашивание гематоксилином и эозином показало, что экспланты сетчатки сэндвича сохранили целостность и отчетливую структуру ламелей от GCL до ONL с компактными ядрами во внутреннем и внешнем ядерных слоях. Нарушенная целостность сетчатки была обнаружена на краях того же образца, где сетчатка отделилась от нижележащих RPE сосудистой оболочки и склеры, показывая уменьшенную толщину сетчатки и потерю ядер в INL и ONL. В ЭКСПЛАНТАХ сетчатки, культивируемых в базальных условиях, не было обнаружено ТУНЭЛ-положительных клеточных ядер, которые отмечают клеточный апоптоз, демонстрируя устойчивую клеточную жизнеспособность даже через 72 часа.

Маркировка GFAP была ограничена GCL и IPL без глиального фиброза, признака патологии, который будет идентифицирован как расширенная экспрессия GFAP в ONL. Виментин был высоко экспрессирован от слоя ганглийных клеток до внешнего ядерного слоя, демонстрируя сохраненную целостность клеток Мюллера, как видно в нормальных тканях сетчатки. Магнитный анализ Luminex показал, что уровни IL-18, VEGF, IL-6 и IL-8 значительно превышали исходный уровень в культурах эксплантата сэндвич-сетчатки в высоких глюкозных и провоспалительных цитокинах через 24 часа.

Через 72 часа уровни IL-18 и VEGF оставались значительно увеличенными, но не было обнаружено существенной разницы в уровнях IL-6 и IL-8. При выполнении этой процедуры оставьте достаточное остаточное стекловидное стекло, которое будет утяжелять сетчатку так, чтобы она не отсоединяла от РП сосудистой оболочки и не плавала в культуральной среде. Культивируемая сетчатка может быть дополнительно охарактеризована с использованием иммуногистохимии и гистологии, в то время как воспалительные цитокины, высвобождаемые в культивируемую среду, могут быть измерены с использованием магнитного анализа Luminex.

Эта модель более клинически трансликулируема по сравнению с моделями животных и in vitro, что делает более подходящим для тестирования эффективности новых терапевтических препаратов при заболеваниях сетчатки.